细胞培养操作流程
记录一下细胞培养相关流程。
基本设备
仪器
超净工作台/生物安全柜、培养箱、水浴锅、离心机、冰箱、血细胞计数器、移液枪、显微镜。
耗材
细胞培养瓶、培养基、吸管、枪头、酒精棉球、废液桶。
前期准备
高压灭菌
- 使用前加去离子水/超纯水，刚好没过圆底。
- 接一盆水，把排气管没入水中。
- 放入灭菌的物品，以两两对称的方式旋紧相对的螺栓，使螺栓松紧一致。
- 将排气阀关闭（即向下）。检查安全阀是否也是关闭状态。
- 打开灭菌锅电源，检查温度和时间设置，点击工作按钮，工作灯此时为绿。
- 灭菌完毕后，关闭电源。等压力表降至0处、温度降至**100℃**以下后，打开排气阀，旋开螺栓，取出灭菌物。
滤器过滤
滤纸
- 水系膜：蓝盒，不能过滤有机物。
- 有机膜：橙盒，既可以过滤有机物也可以过滤水。
组装
将两层滤纸放到垫圈上，凹面朝上。稍微拧紧，用注射剂打空气排水。然后完全拧紧，注射空气看看是否密封。做好以后用硫酸纸包住，在饭盒（铝箔纸包裹）里高压灭菌。
液氮罐操作
存取
- 戴好手套，注意个人防护。
- 查阅登记本，预先确定细胞所在位置。
- 打开液氮罐，将提斗提起，取出复苏细胞/存入冻存细胞。
- 将提斗放回，关闭液氮罐。
- 做好登记。
检查
要求少于1/3即需更换，需要加35L。测量时将吊绳缓缓降入液氮罐，等接触到液氮面时会有呲声，此时观察绳子位置（有红色记号，以最上面为准）。
相关试剂
缓冲液
PBS配置
| 成分 | 50 ml | 100 ml |
|---|---|---|
| NaCl | 0.4 g | 0.8 g |
| KH2PO4 | 0.01 g | 0.02 g |
| Na2HPO4·12H2O | 0.145 g | 0.29 g |
| KCl | 0.01 g | 0.02 g |
PBS配完高压灭菌，注意盖子别拧紧。
D-Hank’s
| 成分 | 50 ml | 100 ml | 200 ml | 500 ml |
|---|---|---|---|---|
| NaCl | 0.4 g | 0.8 g | 1.6 g | 4 g |
| KCl | 0.02 g | 0.04 g | 0.08 g | 0.2 g |
| Na2HPO4·12H2O | 0.0076 g | 0.0152 g | 0.0304 g | 0.076 g |
| KH2PO4 | 0.003 g | 0.006 g | 0.012 g | 0.03 g |
| 葡萄糖 | 0.05 g | 0.1 g | 0.2 g | 0.5 g |
培养基配置
DMEM
| 成分 | |
|---|---|
| 超纯水 | 100 ml |
| DMEM培养基 | 1.34 g |
| NaHCO3 | 0.185 g |
RPMI-1640
| 成分 | |
|---|---|
| 超纯水 | 100 ml |
| RPMI-1640培养基 | 1.04 g |
| NaHCO3 | 0.1 g |
不搅拌，在超净台加1 mL双抗（1%），使用滤器过滤，再加10% 血清（10 mL）混匀，于4℃下保存。血清和双抗使用前24 h应放4℃，使用后血清用封口膜与药胶带封好，4℃保存，双抗-20℃保存（双抗不能反复冻融，因此之前得分装保存）。
胰酶配制
在D-Hank’s中加入0.25%的胰酶粉（常用0.125 g / 50 mL）。
冻存液配置
即含有DMSO和血清的溶液。存在如下几种常见配方，血清也可以按需增加：
- 血清:DMSO = 9:1
- 含血清培养基（血清浓度为10%-20%）:DMSO = 9:1
- 含血清培养基（血清浓度为10%-20%）:血清:DMSO = 7:2:1
培养箱检查
- CO2：注意看示数，左边应该在第一、二格之间；右边的不能太低。大概每3个月就得注意了。
- 水：每1个月就得注意了。水需要取超纯水，高压灭菌后在传送窗冷却，至室温时拿进去倒。
无菌操作
- 玻璃板高度合适，使用前后用75%乙醇擦拭超净台及里面物品。
- 注意摆放原则，减少污染可能。
- 时刻假定手是污染的，进出酒精棉擦拭。
- 细胞转入培养箱中时，带一块酒精棉，注意擦拭接触部分。
细胞培养
细胞复苏
- 应遵守慢冻快融的原则。有水浴锅则将其调至37℃，若没水浴锅，则预先准备热水，温度计示数约37℃时，取出冻存的细胞迅速放入后将细胞面浸至水面以下不断摇动至融化，但注意不要全部浸入水浴锅以免污染。当看到只有一小块冰存在时，即可从水浴锅中取出。
- 打开冻存管迅速将细胞悬液吸到离心管中（离心管中一般预备2倍以上被冻存细胞的培养基，以减少DMSO毒性），轻轻混匀。
- 1000 rpm离心3 min，弃去上清液。
- 用少量（1 mL）培养基将细胞悬起，将细胞悬液转移至事先加入完全培养基的培养皿/瓶中（大致参考：培养皿8 mL，T75培养瓶10 mL）。将细胞混匀后，于显微镜下观察，在10x和20x倍数下拍照，没问题则置培养箱中培养。一般复苏细胞需要24小时内第一次换液。
参考操作视频。
细胞换液
- 观察：一般间隔2~3天，可根据培养基颜色变黄判断，刚复苏细胞最好在24小时内换一次。用显微镜观察生长状态，如果有死细胞样就及时换液。
- 弃液：弃去培养皿/瓶中的培养液，将培养皿盖子半开，使用移液枪吸去现有培养液。
- 清洗：用PBS清洗1-2次，注意别直接冲洗细胞贴附的面。
- 加液：添加新鲜的含血清培养基。
- 培养：显微镜下观察检查是否还有漂浮细胞等，后放入孵箱培养。
细胞传代
贴壁细胞
- 观察：显微镜观察培养细胞的生长状态是否良好、细胞密度是否达到了80%-90%。
- 弃废液：倒（吸）掉细胞皿/瓶里培养液。
- 清洗：用PBS清洗1-2次，以免中和后面加入的消化液。
- 消化：加入适量的胰酶（培养皿约1.5 mL，T75培养瓶约为3 mL）进行消化，轻轻晃动使其覆盖整个瓶底。放入培养箱，孵育3 min。在此期间可以准备好一个干净的管子用于随后操作。消化完毕后，显微镜下大部分细胞应该收缩变圆。
- 吹打：加入适量含血清培养基（约胰酶2倍的量），用于中和胰酶。使用玻璃管轻柔吹打，混匀细胞。
- 离心：将上面混匀的细胞转移至离心管，1000 rpm，3 min。有条件的话可以把离心机设为4 ℃，该温度下可以有效降低胰酶活性以保护细胞。离心完毕后，使用培养基进行细胞重悬。
- 计数（可省）：取少量细胞加入PCR管/离心管，用台盼蓝（Trypan blue）以1:10稀释，用于细胞计数。由于稀释了10倍，因此最后需要×10，以补正倍数。
- 传代比例：根据需求（如1:3），取合适的细胞液分装继续培养。
细胞密度：看本视频。
另一个传代操作视频。
悬浮细胞
一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内，加入完全培养基继续培养，如要高浓度可先离心1000 rpm，5 min后加入完全培养基，轻轻吹匀后，分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养。
细胞冻存
前面的步骤基本上和传代一致。
- 冻存前准备：预先配置好冻存液。
- 观察：选择对数生长期细胞。
- 弃废液：倒（吸）掉细胞瓶里培养液。
- 清洗：用PBS清洗1-2次，以免中和后面加入的消化液。
- 消化：加入适量的胰酶（培养皿约1.5 mL，T75培养瓶约为3 mL）进行消化，轻轻晃动使其覆盖整个瓶底。放入培养箱，孵育3-5分钟。在此期间可以准备好一个干净的管子用于随后操作。消化完毕后，显微镜下大部分细胞应该收缩变圆。
- 吹打：加入适量含血清培养基（约胰酶2倍的量），用于中和胰酶。使用玻璃管轻柔吹打，混匀细胞。
- 离心：将上面混匀的细胞转移至离心管，1000 rpm，3 min。有条件的话可以把离心机设为4 ℃，该温度下可以有效降低胰酶活性以保护细胞。离心完毕后，使用培养基进行细胞重悬。
- 计数：取少量细胞加入PCR管/离心管，用台盼蓝（Trypan blue）以1:10稀释，用于细胞计数。**由于稀释了10倍，因此最后需要×10，以补正倍数。**冻存所需细胞密度一般为1-5×106/mL。
- 冻存：加入冻存液，轻轻吹吸均匀，按每管1 mL的量分装入冻存管。
- 用绳子吊在液氮罐液面以上半天，然后放入冻存管。
- 4℃冰箱20 min，转入-20 ℃冰箱30 min，-80 ℃过夜。
- 有条件则可使用冻存盒，直接可以放入-80 ℃，降温速度基本保持为-1℃/min。最终都放入液氮罐。
一次冻2皿，6管，保证冻存细胞数为10管左右。
参考操作视频。
补充内容
细胞污染
可以看此，了解常见污染原因。
