记录组会将被提问题。
Figure 1 的具体实现步骤
- 设计用的Adobe Illustrator，然后用Tanner L-Edit软件进行了进一步处理。
- 做了一个双层图案化。首先是微通道，由于作者在Figure 6研究通道高度的影响，因此设计了2种高度的微通道：4.7 µm和3.2 µm。其中，4.7 µm是用的SU-8 2005光刻（5000 rpm/60 s），3.2 µm是反应离子刻蚀（负性胶nLOF 2020）。然后再图案化180 µm的分隔壁，用的SU-8 2075，软烘烤（50 °C/6 h），曝光后烘烤（50 °C/6 h），最后硬烘烤（90 °C/15 h）。
- 直接3D打印PDMS。
- 剥离PDMS，然后放在玻片上。播种细胞。
- 健康的神经元在设备上生成，并通过微通道阵列相互连接。
Figure 6里对面的神经细胞是什么，为什么没产生轴突
来自前脑的F‐hNSCs，大部分分化为星形胶质细胞；而来自于中脑腹侧的M‐hNSCs，大部分分化为多巴胺能神经元。
黑质纹状体途径是一种多巴胺能途径，连接了中脑的黑质致密部（SNpc）与前脑中的背侧纹状体。这种多巴胺能连接是单向的，其中多巴胺能神经元从SNpc投射并将多巴胺传递到背侧纹状体。该装置是对黑质纹状体途径的原理验证。上方为F‐hNSCs分化而来的星形胶质细胞，下方为M‐hNSCs分化而来的多巴胺能神经元。
神经细胞染色方案和原理
免疫细胞化学
是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。特点是特异性强、抗体产量高。多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。特点是特异性低，会产生抗体的交叉反应。
DAPI/Hoechst染色
DAPI 可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100 %) ，常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。
Hoechst 33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。也用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。
死活细胞染色
死活细胞染色原理是Calcein AM进入细胞，和活细胞中的酶反应形成Calcein荧光分子，并保留在细胞内部，所以通过Calcein荧光分子来检测活细胞；而EthD-1不能透过活细胞膜，只能进入死细胞和细胞内的基因片段结合后出现荧光，故此检测死细胞。Calcein AM和EthD-1没和细胞接触前不发荧光 。也有用PI染死细胞的。
尼氏染色
神经元胞体里有大量嗜碱性的尼氏小体，可以与碱性染料（焦油紫、亚甲蓝、甲苯胺蓝和硫堇等）结合着色，可以清晰辨别尼氏体、核仁、树突、轴突等，但仅用于尼氏体较为丰富的组织染色。
3D打印的实现过程和原理
这里用的是RegenHU的生物打印机。生物打印机大概分为以下几种原理。
喷墨式：其基本原理是用加热或压电的方法以一定频率将“墨盒”中的“生物墨水”形成墨滴，通过针头喷洒在平台上，构成组织。喷墨式打印要求“墨水”具有较低的粘度，约 3.5 ~ 12 mPa s，即在“墨盒”中处于液态，滴到平台上后迅速固化（交联）。
挤出式：是最常用的一类生物3D打印方式，可以打印粘度更高的生物材料，如水凝胶等。基本原理有两种，一是是采用加热模块将高分子材料熔融变软（200°左右），然后用机械结构将高分子材料拉丝挤出，高温的丝状材料遇到较冷的平台后凝固成型。由于此过程中材料会经历高温过程，因此不适用于含细胞的打印。二是用气压式、螺纹挤出式讲材料挤出打印。
激光式：它可分为激光辅助式和光固化。激光辅助式打印采用激光代替喷墨打印中的加热或压电，聚焦在覆盖在含细胞的生物材料表面的“吸收层”上的一点，形成空泡，将该点的材料连同细胞一起挤出，滴在下面的平台上。光固化是采用激光作为固化的诱因，在激光聚焦的点诱使光致固化的材料固化，从而形成特定结构。
Sylgard 184的普通形式表现为牛顿流体，没有足够高的粘度，无法通过喷嘴可控地挤出并支撑印刷在其顶部的层的重量。
将墨水在双旋转混合器中以2700 rpm的速度混合30 s，然后装入5 cc注射器筒中。为了除去气泡，将注射器在1700 G下离心3分钟。然后用塑料锥形针（内径200 µm）盖住注射器，然后将其装入3D生物打印机。使用真空抽吸将包含母模的硅晶片固定在打印阶段。在BioCad软件（regenHU）中定义了基于母版制造的设计的打印路径。室温下通过气动挤出直接在硅片上进行印刷，其中垫片墨水在550 Pa的压力下挤出，隔室墨水在275 Pa的空气压力下挤出。两种墨水的喷嘴速度均设置为10 mm s-1。垫片墨水以150 µm的层高打印，而隔室墨水以190 µm的层高打印。对于具有PMMA或PLA扩展的装置，只打印了三层隔室墨水，以便存在用于附着纤维的平坦表面。
打印后，将包含打印装置的硅晶片放入60°C的烘箱中2天以完全固化硅弹性体。PLA扩展是使用透明的PLA丝在Felix Pro 3 3D打印机（Felix Robotics）上打印的。使用1.5毫米立铣刀在5 mm厚的PMMA薄板中微磨PMMA延伸部分。将延伸部分贴在一个薄层PDMS弹性体上并在60°C下将装置固化过夜。固化结束后，将单个器件从硅片上剥离下来，并在96％乙醇中灭菌。 通过暴露于空气等离子体将每个装置共价结合到玻璃盖玻片上。
