一种基于水凝胶的三维微流控芯片，用于肿瘤-血管微环境仿生。
Introduction
直到今天，我们对细胞过程的大部分知识都来自于由扁平、坚硬的材料制成的培养皿中进行的实验。尽管操作过程可能很简单，但在二维培养系统中，细胞可能表现出与在体内不同的行为，如扁平的形状、异常的极化和对药物试剂的改变的反应。更重要的是，在这些环境中，细胞只从一个腹侧接收营养和信号并作出反应，而不是像在身体中那样在所有的三个维度中进行反应。因此开发体三维仿生培养系统以理解体内复杂和动态的环境是十分必要的。
水凝胶作为一种水膨胀的聚合物网络，正成为最有希望的选择，因为它们不仅模拟天然的细胞外基质（ECM），而且以类似于软组织的力学性质支持细胞粘附。当谈到细胞如何对外界刺激作出反应时，生长在坚硬、富含胶原蛋白的基质上的细胞往往比生长在较软的胶原蛋白基质上的细胞更耐药。由此我们可以看出，使用水凝胶培养平台时，细胞结果可能存在巨大差异。现在有很多水凝胶可供选择，包括：
- 天然材料，如胶原（collagen）和纤维蛋白（fibrin）；
- 合成材料，如聚丙烯酰胺（polyacrylamide, PAM）和聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）；
- 杂交材料，如透明质酸（hyaluronic acid, HA）。
体内细胞不仅与ECM相互作用，而且还与周围细胞分泌的分子相互作用，如肿瘤巢以及其他器官如内分泌系统中的情况。微流控系统，通过连接众多微通道网络来精确操纵微/纳升流体，整合了多种化学和生物分析方法于单个芯片，具有微尺度、多功能整合和高效率的优点，对于体外微环境仿生很有益处。
然而，在设计用于细胞研究的水凝胶微流控装置时，需要考虑多个因素。一些常用的生物相容性水凝胶仍然会对细胞造成损害，因为它们的凝胶过程包括温度变化（如琼脂糖）、酸性pH值（如胶原蛋白）或紫外线照射（如PEG-DA）。此外一些水凝胶需要特定的操作条件，使其难以引入微流控通道。例如，基质胶需要 在低温下保存和加工，在24-37℃下成胶。因此，有必要引入具有更高生物相容性和更简便操作步骤的水凝胶。目前，水凝胶微流控器件大多用于特殊功能，限制了其可行性。然而集成多个功能单元的设备通常需要复杂的结构和多步骤的制造过程。
Fig. 1. Microfluidic chip design, fabrication and modelling
- （A）微流控芯片设计为上下两层，中间由聚碳酸酯（PC）膜分隔。上层由2个小室组成，由厚度为100 μm的PDMS墙分开。高为270 μm，宽为800 μm，长为1.5 mm。下层为一个宽通道。PC膜孔径为5 μm。
- （B）膜上直径为5 μm的孔隙处的表面张力保证了当下道为空时，溶液仍在上腔，而当下道充满溶液时，扩散迅速进行。
- （C）靠近芯片入口区域的显微图片。
- （D）肿瘤-血管仿生模型设计。
Fig. 2. Synthesis of DF-PEG-GCS dynamic hydrogel and permeability evaluation
- （A）DF-PEG合成和DF-PEG-GCS动态水凝胶形成的示意图。
- （B）荧光素钠在DF-PEG-GCS动态水凝胶中扩散的荧光图像。
- （C）不同时间点，图（B）中心虚线正则化的荧光强度。从右边缘的点300 μm从扩散开始线约50 μm，在30分钟内达到超过80％的强度，60分钟以上超过90％强度。该实验验证动态水凝胶适用于下面的药物刺激实验，因为微流体芯片的通道高度不超过300 μm。
Fig. 3. 3D and z-axis maximum projection views of confocal microscopy images
- （A-F）共聚焦显微镜图像的3D（A，B，D和E）和z轴最大投影（C，F）视图。反映了封装在DF-PEG-GCS动态水凝胶中的HepG2和MCF-7细胞的活性（活细胞：绿色，死细胞：红色）和空间分布。 （A，D）凝胶化后的第1天培养。 （B，C，E，F）胶凝后第5天培养。
- （G-H）HepG2和MCF-7细胞的细胞活性。
Fig. 4. Tumour-vascular microenvironment simulation on the microfluidic device
- （A）肿瘤血管微环境的3D共聚焦荧光图像的侧视图。
- （B）肿瘤血管微环境的3D共聚焦荧光图像的正视图。
- （C-F）蓝色（C），红色（D），绿色（E）激光通道及其合并图像（F）的共聚焦显微镜图像的Z轴最大投影视图。
Fig. 5. Drug stimulation in the tumour-vascular microenvironment
- （A）微环境仿生系统（i）和对照组（ii）在20 μg/mL DOX浓度下的MCF-7细胞的共聚焦显微镜图像的Z轴最大投影图。
- （B）从微环境仿生系统和对照组中细胞的共聚焦图像计算出的MCF-7细胞的细胞活性。
- （C）从微环境仿生系统中的细胞的共聚焦图像计算出的MCF-7细胞和MCF-7 / ADR细胞的细胞活力。
Conclusion
通过开发一种包含三个功能单元的水凝胶微流控装置，第一次成功地构建了肿瘤-血管微环境，包括完整的内皮细胞层、成纤维细胞、乳腺癌细胞及抗药分支。
- 动态共价的席夫碱键合形成的GCS-DF-PEG水凝胶具有高渗透性和生物相容性，支持细胞长期培养和细胞-细胞、细胞-ECM的物质交换。
- 培养在微环境中的乳腺癌细胞的药物响应，显示了明显的活性增加，这种增强的化疗抗性也与体内研究一致。
- 平台可以在相同的化学环境下同时观察敏感和抗性肿瘤细胞。
- 微流控细胞研究中动态水凝胶的应用减少了操作的复杂性，扩展了研究边界。
- 所使用的细胞类型可以很容易地被替换来构建其他组织模型和研究一般的细胞相互作用。
Reference
Wang S, Mao S, Li M, et al. Near-physiological microenvironment simulation on chip to evaluate drug resistance of different loci in tumour mass[J]. Talanta, 2019, 191: 67–73.
